Moleküler Genetik

molukulergenetik

Moleküler genetik departmanı klinik amaçlarla kalıtsal bir hastalığa yol açan mutasyon ve/veya genotiplerin belirlenmesine yönelik çalışmalar yapmaktadır. Hastalığa neden olan mutasyonların saptanmasının yanında bir genetik hastalığın taşıyıcılık analizi ve multifaktöriyel hastalıklara yatkınlık analizi de çalışılmaktadır. Tek gen hastalıkları (Talasemi, FMF), Multifaktöriyel Hastalıklar (Kanser), Mitokondriyal Hastalıklar (LHON) moleküler genetik departmanında çalışılmaktadır.

Rutin Genetik analizlerde merkezimizde kullanılan  bazı teknikler aşağıda sıralanmıştır.

  1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
  2. PCR (Polymerase Chain Reaction)
  3. Sequencing
  4. RT-PCR (Real Time PCR)
  5. Heterodubleks analizi

RFLP: Restriksiyon endonükleazlarla (DNA’ yı belirli bölgerinden kesen enzimler) DNA’nın farklı büyüklüklerdeki fragmanlara ayrılarak incelenmesine dayanmaktadır. Genotipleme, polimorfizm çalışmalarında yaygın şekilde kullanılmaktadır.

PCR

PCR

PCR: Belirli bir DNA bölgesinin primer olarak adlandırılan bir başlatıcı yardımıyla enzimatik olarak çoğaltılmasıdır. Belli bir DNA parçasının milyonlarca kopyasının çıkartılmasını sağlamaktadır.

 

*Denatürasyon: İlk aşamada DNA molekülünün çift zincirli yapısı yüksek ısı yardımıyla birbirinden ayrılır (denatürasyon) .Çoğunlukla 94-97°C arasında 15-60 sn süresince uygulanır(İlk denatürasyon tek döngü olarak 15 dakikaya kadar uygulanır).
*Annealing(Bağlanma): Denatürasyonu takiben daha düşük ısılarda oligonükleotid primerler, ayrılmış olan tek zincirli DNA üzerinde kendi eşlenikleri olan bölgelere bağlanırlar. Bu olay çoğunlukla 47-60°C arasında 30-60 sn ‘de gerçekleşir (G/C oranı yüksek olan bölgelerde bağlanma ısısı 68°C’ye kadar arttırılabilir.
*Elongasyon(Uzama): Son aşamada ısı 72°C’ye kadar arttırılarak DNA polimeraz enziminin tamamlayıcı DNA zincirini uzatması sağlanır. Elongasyon basamağının süresi, kullanılan polimerazın cinsine ve amplifiye edilecek DNA‘nın uzunluğuna göre 30sn ile 3 dakika arasında değişir.

 

 

 

 

 

Sekans Analizi

Sekans Analizi

SEKANS ANALİZİ: Dizisi bilinmeyen bir DNA bölgesindeki nükleotitlerin dizilimin belirlenmesi işlemidir. Genlerde meydana gelen bazı nükleotit değişimleri mutasyon olarak adlandırılır ve çeşitli kalıtsal hastalıklara neden olur. Hastalığa sebep olan gen bölgesi Sekans Analizi tekniği ile taranarak mutasyonun gen üzerindeki yeri tespit edilir. Sekans Analizi aletlerinin geliştirilmesi ile birlikte sekanslama işleminin süresi kısalmıştır. Beta Talasemi, FMF gibi bir çok tek hastalıklarında en kesin sonuç sekanslama yöntemiyle alınmaktadır.

 

 

 

 

 

 

 

 

Real Time-PCR

Real Time-PCR

Real Time-PCR: Real-time PCR reaksiyon esnasında her bir PCR döngüsünde yeterli miktarda ürünün verdiği floresans ışığa göre çalışıp reaksiyonu aşama aşama, sonuna kadar oluşan ürünü kontrol eden bir sistemdir. Real-Time PCR, PCR ürünlerinin miktarını eş zamanlı ölçebilen bir sistemdir. Enfeksiyon testlerinde ve hematolojide çokça kullanılmaktadır.

 

 

 

 

 

 

 

Heterodupleks Analizi

Heterodupleks Analizi

HETERODUPLEKS ANALİZİ: Heterodupleks analizi, referans DNA (normal DNA) ile mutasyon içeren DNA arasındaki dizi farklılıklarını belirleyen bir yöntemdir. Referans ve test edilen DNA karıştırılır, ısı kullanılarak denatüre edilir ve soğutularak DNA’ların hibrid oluşturması sağlanır. Yeni oluşan DNA çiftinde (dupleks) bir iplik referans DNA’ya ait olurken diğeri araştırılan DNA’ya aittir.
Eğer iki DNA dizisinde farklılık var ise aynı noktada iki baz eşleşemeyecektir. Böylece heterodupleks bir form oluşmaktadır.
Heterodupleksler elektroforezde homoduplekslere göre daha yavaş hareket edeceğinden kolayca ayırt edilebilirler. Heterodupleks analizi yaygın olarak genlerde mutasyonların belirlenmesinde kullanılmaktadır.

 

 

 

 

Yeni Nesil Dizileme (Next Generation Sequencing)

Yeni Nesil Dizileme

Yeni Nesil Dizileme

Yeni Nesil Dizileme (Miseq)DNA dizi analizi; yüksek kalitede baz dizileme olanağı ile genetik hastalıkların tanısında yaygın olarak kullanılan zincir sonlandırma yaklaşımına dayalı bir yöntemdir. Günümüzde kullanılan teknikler arasında halen altın standart olarak bilinmektedir.  Ancak, okuma uzunluğunun kısıtlı olması nedeniyle milyonlarca baz içeren genomun tamamını dizileme çalışmaları bu yöntemle oldukça zor olmakta ve uzun sürmektedir.

Yeni nesil dizileme (Next generation sequencing) sistemleri ile bir çalışmada tüm genom, transkriptom veya daha küçük hedef bölgelerdeki milyonlarca DNA fragmenti dizilenebilmektedir.

 

 

 

Miseq Dizileme: NGS teknolojisinin Sanger dizileme yöntemi ile karşılaştırıldığında daha hızlı, daha az maliyetli ve yüksek verimli dizileme olanağına sahip olduğu görülmektedir. Bu yöntemle, insan genomunun yüksek verimlilikte dizilenmesi, hastalıklarla ilişkili genlerin ve regülatör elementlerin keşfedilmesini kolaylaştırmaktadır.

 

 

 

 

Laboratuvar Süreci

Laboratuvar Süreci

Laboratuvar Süreci: MiSeq cihazı, DNA sentezi sırasında eklenen her bir bazı belirleyerek büyük ölçekte paralel dizileme (aynı anda çok sayıda dizileme) yapmaktadır ve bu yöntemle, küçük boyutlarda olan genomların tamamı bir gün içinde dizilenebilmektedir.

Aynı zamanda, hedef dizileme ile patolojik mutasyonlar belirlenebilmektedir.

 

 

 

 

Testlerimiz:

  • Akondroplazi / Hipokondroplazi (G1138A, G1138C)
  • Beta Talasemi (Tüm Gen Dizi Analizi)
  • BRCA1, BRCA2 (Tüm Gen Dizi Analizi)
  • Charcot-Marie-Tooth (CMT1A, CMTX)
  • Duchene / Becker Musküler Distrofi (DMD, BMD)
  • Faktör II – Protrombin (G20210A)
  • Faktör V Leiden
  • FMF (Akdeniz Ateşi) 12 Mutasyon
  • FMF (Akdeniz Ateşi) Dizi Analizi (Exon 2, 3, 5, 10)
  • Frajil-X Sendromu
  • HLA B27
  • Hemakromatozis (H63D, S65C, C282Y)
  • Huntington Hastalığı
  • Kardiyovasküler Risk Paneli [ (Faktör V G1691A(Leiden) – Faktör V H1299R (R2) – Protrombin G20210A – Faktör XIII V34L – Beta Fibrinogen (-455 G-A) – PAI-1 (4G-5G) – GPIIIa L33P (HPA-1) – MTHFR C677T – MTHFR A1298C – ACE I /D – ApoB R3500Q – ApoE (E2, E3, E4) ]
  • Kistik Fibroz (DF508)
  • Kistik Fibroz (36 mutasyon)
  • Kistik Fibroz (550 mutasyon)
  • Kistik Fibroz (Tüm Gen Dizi Analizi)
  • Konjenital Sağırlık (Connexin 26)
  • K-Ras (codon 12-13 mutasyonları) – Uluslararası Akredite
  • Jak2 (V617F)
  • MTHFR (C677T, A1298C)
  • Miyotonik Distrofi
  • Spinal Musküler Atrofi (SMA Exon 7, 8 Delesyonu)
  • Rett Sendromu
  • Trombofili Paneli (Faktör II, Faktör V, MTHFR)
  • Y kromozomu Mikrodelesyonları